音階理論の発達に対するピュタゴラスの貢献は大きい。彼は単純な音程は弦長を簡単な整数比に分割した時に、この２つの部分から発せられる音によって作られるということを発見し、この弦長比の単純さこそ快い響きの音程を作る究極的な根拠であると考えた。そして振動弦が分割された２つの部分の長さの比が簡単であるほど、２つの音の響きはよく協和すると結論づけた。そして「万物の究極は数である」と信じていた彼はこの問題に関しても、音程は耳で判断するよりも数で知的に判定すべきであると考えた。確かに振動数が振動弦の長さに反比例することを知っていれば、振動弦の長さではなく振動数だけで考察していくことができるのである。

　ピュタゴラスは８度と５度という簡単で明瞭な音程に基づいて音階上の全ての音程を解明した。この方法で作られた音階の音程はＣを基音とすると〈Ｃ−Ｄ、Ｄ−Ｅ、Ｆ−Ｇ、Ｇ−Ａ、Ａ−Ｂ〉の５つの全音と、〈Ｅ−Ｆ、Ｂ−Ｃ'〉の２つの半音からなる。この半音を「ピュタゴラスの全音階的半音」という。そしてこの５度音程を積み重ねてはオクターブ下げる操作を繰り返すことで元のＦ音とＧ音の中間に新しい音（Ｆisと呼ばれる）ができるが、この音とＦとの間に生まれた新しい音程を「ピュタゴラスの半音階的半音」という。これ以上仔細な説明は省くが、この「ピュタゴラスの全音階的半音」と「ピュタゴラスの半音階的半音」の和は１全音となり、差を「ピュタゴラス・コンマ」という。

　この５つの全音と２つの半音の配列からなるいわゆるピュタゴラス音階は現在使用されている音階と非常に良く似ている。ただこの音階では７つの音のそれぞれにシャープ（♯）及びフラット（♭）を付けることにより、全部で２１個の音となっている。一方現在私たちが使用している音階は、ある音の♯音とすぐ上の音の♭音を等価のものとして扱い、全部で１２個の音からなっている。

　１５６０年頃、ヴェニスのツァルリーノによってピュタゴラス音階に基づくテトラコードの連結が修正された。このツァルリーノの音階とピュタゴラスの音階を振動数比で比較してみると次のようになる。ピュタゴラスの音階は８度と５度だけを使って構成されるので、その結果振動数は複雑になる。特に３度音、６度音、７度音は複雑だ。それに比べるとツァルリーノの音階の方は非常に簡単である。これは低い序数の部分音を共有しているということであり、単に算術的に簡単なだけではなく、実際に耳で聞いて感知できる関係であるということだ。

　そしてこれは調性の原理にも適っている。ツァルリーノ音階の３度音、４度音、５度音、６度音は主音との間に簡単な振動比を作っている。そして残る２度音と７度音の２つも、主音ともっとも深い関係の属音との間に簡単な振動比を作っている。振動比が互いに簡単な関係の音は、同時に鳴らすと共和音を作る。和声の発生がこの条件を満たすような音の組み合わせの必要を強めたのだが、このツァルリーノ音階の３度音、４度音、６度音、７度音はいずれも協和音を作るので、一般には自然的音階もしくは「純正音階」と呼ばれている。

　この２つの音階は２度音、４度音、６度音、８度音において等しいが、３度音、６度音、７度音においてはピュタゴラス音階の方が振動数比にして８１／８０ずつ高い。この音程はシントニック・コンマといいピュタゴラス音階の３度（８１／６４）とツァルリーノ音階の長３度（５／４）との差（＝８１／８０）だ（※１）。日本の音響学者田中正平はベルリンでヘルムホルツの元で学び、１８８９年に純正音階で調律したオルガンを制作したが、その楽器には１オクターブに鍵盤が２１鍵あり、これで純正３１音が演奏できた。しかしそれでも純正調の１オクターブを鍵盤に納めるには、５３個の鍵盤が必要である。

　これら純正協和音程は数学的に美しいだけではなく、実際に鳴らした時にその音響的パターンが互いに干渉しないので、うなりや濁りを生じない（下表）。これらの振動数比と＜振動数４４０ＨｚのＡ’＞音の標準高度とを用いて、ハ長調の「純正」長音階における全ての音の振動数を計算することができる。その下のハ長調の「平均律」長音階と比較してみよう（※２）。またＣを基音として協和音程比の簡単な方から表わしたものが、下の＜表２＞である。なお下図は＜Ｃ−Ｃ’＞間の平均律音階における７つの幹音の振動数。ｎオクターブ上の音は、それぞれの数字に２ⁿ倍すればよい。

（※１）ピュタゴラス音階の３度（８１／６４）とツァルリーノ音階（純正律）の長３度（５／４）の差は、通分すると８１／６４と８０／６４。この８１と８０のずれが、この２者のずれ。ところで１／８１および８０／８１は以下の通り。
　　　　　　１／８１＝０．０１２３４５６７９ 　（アンダーラインは循環集数）
　　　　　８０／８１＝０．９８７６５４３２１０ （アンダーラインは循環集数）
　　なおピュタビラス音階の３度の比は８１：６４（＝３⁴：４⁴）だが、この比の和は＝３⁴＋４⁴＝１４４＋１＝１２²＋１＝１４５である。一方８０：６４は１４４である。
（※２）音高表示はヘルムホルツ表記では２６４Ｈｚをｃ’、５２８Ｈｚをｃ”というように表記するが、ここでは基音をＣとしてある。