TALK-071

福岡在住のＯ氏より、コロナウイルスの形状に関する2020年の科学論文の所在を教えていただいた。今までウイルスのカプシドは正20面体系の構造をしているというのがほぼ共通認識だったが、コロナウイルスの構造が切頂８面体として捉えられるという内容なのである。個人的には３軸直交の系と５重回転対称性の系の乖離と再交差についての新しい在りようについて着目し始めているところでもあり、「動く綿棒多面体」もまた、３軸直交の系と５重回転対称性の系の接続を考えていたところなので、全くの素訳・荒訳で意訳や誤訳もあるけれど、順次修正していくとして、取り敢えず全文をここに上げてみる。
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A structural model for the Coronavirus Nucleocapsid
　　　　　　　　コロナウイルスのヌクレオカプシドの構造モデル
Federico Coscio,?,† Alejandro D. Nadra,‡ and Diego U. Ferreiro?,¶

■概要■

私たちは、コロナウイルスのヌクレオキャプシドの中規模(メソスケール)モデル構造を提案している。これはＮタンパク質の基本構成要素の高解像度構造、低温電子顕微鏡による視覚化(イメージング)、および全体的な準球状粒子の数学的制約から組み立てられたものだ。この構造は切頂８面体であり、Ｎ末端ドメインの３角形と４角形の格子からなる外殻と、Ｃ末端ドメインのコイル状の平行螺旋からなる等価な格子の内殻の２つの層を収容する。このモデルは巨大なウイルスゲノムを収納する際に予想される寸法と一致しており、コロナウイルスの見かけ上の多形性を解釈するための根拠となる。

キーワード：コビド；構造；キャプシド；テッセレーション；形態

■はじめに■

「限りなく小さいものを、できるだけ正確にコピーして、自分がやりたいと思ったことをやってみたい。
限りなく小さいものをできるだけ正確にコピーして、その大きさを意識することだ。」 M.C.エッシャー

コロナウイルス（CoV）のＮタンパク質は、ウイルスＲＮＡと結合し、ビリオンコアを形成するリボヌクレオタンパク質（RNP）の主要な構成要素を形成する多機能な要素である。CoVに関する重要な情報の欠落は、RNP複合体の原子構造の解明が困難なことにある。CRNP複合体は溶解性が低く、Ｎタンパク質の全長が壊れやすいという性質を持っているため、その解明は困難だった。Ｎタンパク質は、高度に保存された３つの異なるドメインから構成されている。すなわちＮ末端ドメイン（NTD、約180アミノ酸）とＣ末端ドメイン（CTD、約160アミノ酸）という２つの構造的に独立して折り畳まれた領域と、本質的に不規則な領域（LKR、約70アミノ酸）だ。Ｎタンパク質の自己組織化は多くのウイルスで確認されており、ウイルスのキャプシド形成に必要である。NTD、CTDともに様々な結晶形態の高分解能構造が存在する。

現在のCoVのビリオンモデルでは、大きさ（80120 nm）と形状にバリエーションがあるほぼ球形の多形粒子が描かれている（レビューあり）。このRNPは、一般的な生体膜の約２倍の厚さ（7.8 nm）を持つ脂質のエンベロープに包まれている。ウイルスのエンベロープが破壊され、内部の内容物が放出されたサンプルによる初期の研究では、いくつかのCoVのRNPが螺旋対称性を持つように見えることが示された。しかし、ある条件下では、中間的な球形のヌクレオカプシドが報告されている。これらの構造は多角形をしており、Sタンパク質と脂質を含まず、ＲＮＡとＮタンパク質に加えてＭタンパク質を含んでいた。これらの集合体は付加的なウイルス構造を表していると考えられた。すなわち螺旋状のRNPを取り囲む、おそらく正20面体の殻状のコアである。

クリックとワトソンが早くから指摘していたように、ウイルスは高度な対称性を示すはずである。これはウイルスゲノムの中でカプシドを形成するタンパク質をコード化する能力が限られているため、遺伝的効率の結果として生じるものだ。カスパーとクルーグは、この考えを拡張して、より大きなウイルスが形成されても、カプシドをコードするために必要なゲノム配列の相対的な部分はさらに小さくて済むという「準等価性の原理」を導入した。最近、TwarocとLuqueはこの理論が正20面体および正８面体構造の包括的な設計原理の特殊なケースであり、アルキメデス立体格子とその双対の観点から定式化できることを示した。基本的な対称性のルールは、特定のサイズと形状の構造体をより小さなサブユニットから構築しなければならない場合、パッキングの配置を繰り返さなければならず、したがってサブユニットは対称性の操作によって関連している可能性が高いという一般的な原則を意味している。球状のウイルスは、４面体、立方体／８面体、12面体／20面体の３つの可能な立方体点群のいずれかに含まれなければならない。

ここでは、NTDおよびCTDの高解像度構造からのボトムアップ的アプローチと、準球状粒子の数学的モデルからのトップダウン的アプローチを組み合わせることで、CoVのヌクレオキャプシドの中規模(メソスケール)モデルを構築した。

■結果■
　構成要素の多面体近似
　　
基本的な構成要素から形を構築するためには、モジュール性が必要条件となる。したがって構造タンパク質は，ある種の幾何学的形状に従ったモジュールで結合し，単量体，二量体，三量体などとして存在しなければならない。球形に近い構造を構築し、弾力性を最適化できる可能性は限られている。これらは代数学的に構築することができ、正多面体、その切頂体、その双対、測地線幾何の組み合わせで３次元形状として表現できる。

これらの多面体には、正20面体、正８面体、正４面体の３つの代数的な起源があり、２次元と３次元の空間を切り子細工状にする能力がある。現在では、ほとんどのウイルスは20面体という球形に近い効率的な戦略を採用していると理解されている。さらに効率的な形態の例としては、20-12面体(32面)や、その双対の菱形30面体(30面)がある。８面体と６面体は代数的に結合しており、切り捨てと測地線の反復により、球に近い体積を占める多面体の集合を生成することができる。その代数的な起源を考えると、これらは自己の類似した構成要素によって可能であり、変調することができる。我々が提案するモデルの概要を図1に示す。

図1：ヌクレオカプシドモデルの全体構成。Ｎタンパク質の球状ドメインによって、切頂８面体の２つの同心円状の殻が作られている。NTDは外側の面を切り子細工状にし、CTDは連続したコイルを巻いて内側のシェルを詰める。不規則領域であるLKRが２つの多面体をつなぐ。

CoVのRNP構造に８面体形状が好まれるのには、基本的な特性がある。この形状により、多面体は連続した直線的なコイルで構成することができる。つまり同一のモジュールで構成された１つの線形要素であり、RNPの場合は長く連続したRNA鎖を保持する大きなチューブ状の螺旋体(ヘリコイド)である。切頂８面体の頂点は、直線的かつ周期的な方法で同型の正方形となる。一方、正20面体の５角形の頂点の方は非線形の非周期的な構造でのみ可能であり、線形の変調されたコイル巻線では構築できない。そのため、CTDは８面体に似た形状の螺旋を形成し、螺旋構造を維持したまま135?で回転できる糸筋を構築することができる。

■外部シェル■

NTD(pdb 6M3M)は長軸方向に約4.2nmの非対称単位を持ち、近似した３角形状の４量体を形成することができる(図2b) 。また、NTDは扁平な４角形の４量体を形成することができる（pdb 6VYO、図2c）。

低音電子顕微鏡法を用いた実験によると、成熟したCoVsビリオン内部の平均直径は約100nmである。電子密度は、膜から約15nmの距離で、約25nmの深さで観察された。外殻については、非切頂８面体のエッジが70nm、対角線の距離が76nm、正８面体を刻む球の直径が98.9nmである。切頂８面体の６角形の面の順序は、幾何学的中心が５nm離れた３角形によって調節されている（図2の緑の点）。各４量体は、２つの正３角形で埋め尽くされた形状に一致しており、２つの単量体が外側を向き、２つの単量体が内側を向くような複雑な形で重なり合わずに形成される（図2b）。６角形の切り子面(ファセット)は６ｘ４のモジュールで、正方形の切り子面は４ｘ４のモジュールで形成されており（Fig.1、Fig.2a）、NTDの切り子面の総数は2752個である。低音電子顕微鏡では、この寸法に適合する３角形の副結晶格子が観察された。

■内部シェル■

ビリオンが破壊されると、幅9～15nm、長さ数百nmの管状の形状をした破片が放出される。原形を留めていない試料を観察したところ、RNPの主要部分は内部側に約25nmの位置にあることがわかった。ウイルス膜近傍のタンパク質は、無秩序なコアを囲むように重なり合った格子状に配列されている。ここれらの深さでの原子密度を調べたところ、菱型、３角型、４角型と解釈できる周期的なパターンが見られたが、正20面体の形状を示す証拠は見られなかった。

図2：外殻の説明図。 A) NTDは、切断された膜の６角形と４角形の両方の面を充填することができる。A) NTDは切頂８面体の６角形と正方形の両方の面を充填することができる。B) NTDの４量体の高分解能構造(pdb 6M3M)を３角格子（緑の点）に組み立てた状態の高解像度構造。２つの４量体が赤で示した菱形を構成している。C) NTDの4量体（pdb 6VYO）の高分解能構造。

CTDドメインは、回転対称のC1.2.1という偏性２量体で、長さは5.6nmである（pdb 2CJR）。この構造は２枚の反平行板が幅10nmのバタフライ状になった８量体の形で、２量体間の角度がほぼ45°になるように構成することができる（図3a）。この構造は、モジュール間の90°と45°の２種類の回転にも対応できる（図3c）。

CTDは８面体に似た形状の筋を形成し、螺旋構造を維持したまま135°方向に回転する螺旋を構築することができる（図3c）。切頂８面体の６角面と４角面の間の２面角度は正確に135°である。螺旋に沿って同じ方向に回転させると、チューブは元の方向に90°回転する（図3c）。

ビリオン内でのRNPのパッケージングのために提案された構造は、CTDによって形成された幅約10nmの螺旋がチューブ状に配列されたものである(図3d）。これらの直線的な配列は、CTDの８量体では約８nm、４量体では約４nmの区分(セグメント)で変調されている(図3a）。６角形の切り子面は６×４、４角形の切り子面は４×４のモジュールで構成されている(図1）。74個のCTD４量体からなる６角形が８個、16個のCT４量体からなる４角形が６個ある。螺旋体(ヘリコイド)の巻線は2752個のCTDで完成し、RNPの直線的な延長は約11000nmで、これはCoVの完全なゲノムを詰めるのに予想されるサイズと一致する。螺旋体の巻きを形成するヘリコイド集合体は、NTDの外殻の構造と一致しており、６角形の切り子が頂点に近づくにつれ、各レベルにｎ-１個の３角モジュールを含むようになっている(図4）。また10nmのチューブ状の配列が2.5nm積み重なり、各レベルに５nmが残るようにパッキングされている。

■シェル間の関係■

CTDモジュールは4nm、NTDモジュールは5nm離れているので、NTDで構成される多面体は20％大きくなる。NTDのシェルの切り子の厚さは4nmである。両多面体の外部切り子面間の空間が７nmであることを考慮すると、間隙は約３nmである。NTDの内側には2nmの突起があり、CTDの筒状の部分とぴったりと重なっている（図4）。NTDとCTDはLKR領域で繋がっており、両球状ドメインはRNAと相互作用することが分かっているので、間隙にはLKRとCTDの螺旋に沿って巻かれたRNAが入っているのではないかと推測される。

図3：内部シェルの構成。　A）CTDオクタマーは蝶の形をしたモジュール（pdb 2CJR）を形成しており、その向きに応じて異なる色（B）で表されている。C) CTDモジュールのパッキングにより、ヘリカル構造を維持したまま135°回転できるヘリカルを構築することができる。D) 連続して135°回転させると、ヘリックスは元の方向に90°移動する。

低温電子線トモグラフィーにより、コロナウイルスのヌクレオカプシドがエンベロープから隙間によって分離されていることが示された。この隙間には、ウイルス膜の内側の面にあるタンパク質密度と、２次元的に配列されたリボ核タンパク質層をつなぐ糸状の密度があることが明らかになった。局所的なペアでは、Ｍタンパク質に起因する余分な内部層の存在が明らかになったが、我々が提案する複合モデルにも合致する。さらに、核タンパク質密度は副結晶のRNPシェルとして観察され、RNP格子の接触点で部分的に組織化されている可能性がある。ウイルスコアにおける密度の分布は、コイル状のリボ核タンパク質が局所的に接近して形成された膜近位のRNP格子と一致した。粒子の内部ではコイル状の構造やチューブ状の形状が観察され、CTDの螺旋モデルと一致していた。リボ核酸タンパク質は広範囲に渡って折り畳まれているようで、コンパクトな構造をしており、4nmの距離でエンベロープに密着していた。このことは、ウイルスのエンベロープが驚くべき厚さになるための追加の層が存在することを示している。

図4：ヌクレオキャプシドの構造を表現した図。A) 膜とSおよびMタンパク質は青色で描かれている。外殻は透明な茶色の切断された正八面体で表現されている。内部には、青とシアンのCTDヘリックスの連続したコイルパッキングが描かれている。B) LKR領域で連結されたNTDモジュール（2つの4量体）とCTDモジュール（4つの2量体）の高解像度構造。

■おわりに■

ウイルスのヌクレオカプシドは、長い連続した核酸の鎖を効率的に秩序立てて詰める構造戦略に従わなければならず、そのために一貫した形態を採用する必要がある。同時に、生物学的には構成要素を分解したり再構成したりする多様性が求められる。この場合では、RNAとタンパク質の螺旋管状収納である。私たちが提案するのは、これらの構成要素はビリオン内部に任意に詰め込むことはできず、調節されなければならないということであり、頑丈に構築された構造形態を意味している。我々が提示したモデルは、既知のＮタンパク質の基本要素の高解像度構造、それらの化学量論、およびクライオ電子顕微鏡とクライオ電子トモグラフィーで観察された格子密度と互換性がある。この８面体構造は、膜を持たない小型のヌクレオカプシドであるバクテリオファージMS2（pdb 2VTU19）でも以前に観察されている。しかし、多くのEM研究では、我々が提案するような明確な８面体のヌクレオカプシドは観察されず、むしろほぼ球形の多形粒子が記述されている。私たちは、これらの観察結果を現在のモデルで再解釈できることを提案する。CoVの見かけ上の多形性は、RNPによるものではなく、ヌクレオカプシドを取り囲む膜の変形によるものである可能性がある。カプシドが８面体であれば、膜は切り子面部分で平らになり、強い変形のように見えるかもしれない（図5）。CoVでは、膜とヌクレオカプシドの間の距離が15nmの未整理領域に達することがあることを思い出してほしい。つまりこの距離は切頂８面体の頂点間で変化し、切り子面の中心よりもはるかに近くなる可能性がある。このような場所は、ビリオンの組み立てに必要な成分として知られているＮタンパク質がとＭタンパク質と相互作用する場所である可能性がある。コロナウイルスのＮタンパク質は、コロナウイルスによって引き起こされる病気に対する魅力的な創薬標的である。コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質を標的とした様々な化合物が開発されており、その多くは抗ウイルス活性を示す。

図5：コロナウイルスの見かけ上の多形性。A）とE）のパネルではAlmeidaら21人が、その他のパネルではNeumanら17人が観察した電子顕微鏡による密度と、モデルのさまざまな視点を重ね合わせて示している。スケールバーは100nm。

■Acknowledgement ■謝辞

この研究は、アルゼンチン国立研究評議会（CONICET）、国立科学技術振興機構（ANPCyT）、ブエノスアイレス大学、NASA宇宙生物学研究所の支援を受けています。ブエノスアイレス大学、NASA宇宙生物学研究所。ADNとDUFはキャリア CONICETの研究員

(※)オリジナル論文はこちら　⇒　https://arxiv.org/pdf/2005.12165.pdf

(※)翻訳に関しては、最初にまずDeepＬのお世話になりました。本当にありがたいです。凄い世の中になったものだとも思います。

2021.08.14 Saturday